一、介紹

   為了尋求產生終身保持功能的軟骨修復組織的技術，已經探索了廣泛的方法。1.雖然有些技術，如自體軟骨細胞植入（ACI）的各種變體2和關節分散注意力3，產生有希望的臨床結果，這些方法都沒有被證明可以*恢復適當的透明軟骨。另一種在再生醫學的其他領域（如膀胱，氣管和腸道的恢復）中產生了非常有希望的結果的替代技術是使用基于去細胞化細胞外基質（ECM）的支架。4.該技術的優點是創建了一個天然ECM元素的環境，該環境可能仍然包含各種適當的生物活性線索，而沒有細胞成分的存在，從而避免了免疫學問題5，6。此外，它確實允許異種方法，因為ECM蛋白在物種之間高度保守。研究已經證明了軟骨衍生基質（CDM）支架的潛力，因為培養的間充質基質細胞形成了豐富的新的含糖胺聚糖（GAG）和含II型膠原的軟骨基質 7.在異位6，8和原位位置的小動物模型中的體內研究進一步強調了效力9，10。

   CDM支架對于修復骨軟骨缺損可能很有趣，因為它們可以定制成骨軟骨塞，可以以壓接方式插入，避免不安全或復雜的固定技術，這些技術可能會對周圍和相對組織造成損傷11.它們也有可能成為現成的產品，因為不需要植入前培養。然而，這種方法需要同時再生骨和軟骨組織。從理論上講，這可以通過使用復合支架或單個支架來實現，該支架將允許根據周圍的原始組織形成兩個組織。

   在這項研究中，開發和使用了一種基于CDM的支架。CDM主要由II型膠原蛋白組成，在沒有GAG和細胞的情況下12 并且單獨使用，或與三維（3D）打印磷酸鈣（CaP）水泥基經過驗證的成骨支架13，14結合使用以填充馬的股骨顱關節中的骨軟骨缺損。馬模型被視為骨科疾病的*佳和挑戰性的模型之一15，16。據推測，骨軟骨缺損的軟骨部分會隨著新組織接近透明軟骨而愈合，并且復合支架將顯示更好的骨形成并導致更好的整體解剖重建。

二、方法

   （1）實驗設計

   支架植入直徑為11 mm，深10 mm的圓柱形缺陷，這些缺陷是通過手術在內側股骨車嵴的軸側形成的。進行了為期8周的試點研究，以評估對CDM支架的短期反應。為了減少實驗動物的使用，使用了一匹注定要被犧牲用于教育目的的馬。在這種情況下，沒有使用CaP腳手架。在為期6個月的主要研究中，每匹馬都接受了單獨使用CDM支架（−P）和由CDM和3D打印CaP支架（+P）組成的復合支架的治療。馬1-4分別接受了左股骨和右股骨葉關節的治療-P和+P。對于馬5-8來說，這是顛倒的。

      （2）手術

   在用甲苯噻嗪（1.1mg / kg，比薩）靜脈注射（IV）術前后，靜脈注射（2.2mg / kg，霍利迪）和（0.05mg / kg，霍利迪）誘導馬匹，并將其置于背臥位。 在氧氣中使用異氟醚維持全身麻醉。

   通過中髕韌帶和內側髕韌帶之間5 cm的切口進行顱股骺小型關節切開術17。每個內側股骨滑車嵴中側的骨軟骨缺損是使用動力驅動的鉆頭形成的。在植入前用鹽水溶液（Careflex）沖洗缺陷部位和關節。將支架壓接植入每個缺陷中。將傷口縫合成四層（關節囊，深筋膜，淺筋膜和皮膚），并在切口上施加支架繃帶。

    （3）生物力學測試

   對來自同一動物的健康軟骨和缺陷組織進行了微壓痕實驗。使用帶有球形壓頭（半徑：73μm，懸臂剛度：15.6 N/m）的位移控制納米壓頭機（荷蘭Piuma）獲得基于壓痕的載荷-位移曲線18.3 × 3 壓痕矩陣 （n = 9），覆蓋 600 × 600 μm2執行區域，對應于每個點之間的300μm距離。實際壓痕深度在8微米范圍內。楊氏模量是根據奧利弗-法爾理論計算的，使用卸載曲線的初始斜率和估計泊松比0.519.

   經過生物力學測試，將一半樣品固定在福爾馬林中，并進一步加工用于石蠟包埋。從剩余的組織樣品中，切除缺陷的軟組織并進行處理以進行生化分析。

三、結果

   （1）尸檢時的宏觀外觀

   在時，手術部位很容易通過軟骨上的壓痕識別（圖3）;而在植入時點，植入物已小心地與周圍的軟骨齊平。所有部位的外觀相似，治療之間沒有宏觀上可見的差異。

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圖 3.尸檢時手術部位的宏觀視圖（植入后6個月）。

    （2）生物力學分析

   生物力學測試表明，−P和+P處理的缺陷的修復組織都非常柔軟（平均楊氏模量302 KPa（CI 177-427）分別為−P和261 KPa（CI 148-374），剛度明顯小于正常相鄰軟骨（平均楊氏模量為−P 2385 KPa（CI 2009-2761）， 對于 +P 2372 KPa （CI 2036–2708） （P < 0.0001））。−P組和+P組的修復組織之間沒有差異（P>0.05）（圖5）。

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圖 5.Young修復組織模量與僅用CDM（−P）或CDM加CaP支架（+P）治療的病變的正常軟骨的模量。*P < 0.0001，n = 8 表示所有組。

  （3）生物化學

       根據組織學觀察，缺陷中的GAG產生有限。−P條件下的GAG，DNA和GAG / DNA值分別為25.67（CI 17.27–34.07）μg/mg組織，1.57（CI 1.35–1.79）μg/mg組織和16.54（CI 12.09–20.99）。對于−P，這些值為12.32（CI 9.88-14.82）;分別為1.74 （CI 1.63–1.85） 和 7.13 （CI 6.63–8.63）。對于膠原蛋白參數，HYP值為11.63（CI 10.47-12.79）和8.78（CI 7.03-10.53）Hyp / mg組織。−P組和+P組間的GAG和膠原蛋白含量無顯著差異（圖6）。

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圖 6.平均GAG（A）和羥脯氨酸（HYP，μg / mg干重;（B）作為膠原蛋白含量的量度，6個月后修復組織的含量。

四、討論

        自組織工程早期以來，關節軟骨一直是目標組織之一。22.然而，很快就發現，在經典的較小實驗室物種中進行廣泛的體外測試，雖然在初始發育階段仍然是絕對必要的，但不足以評估臨床環境中旨在修復軟骨或再生的任何療法。23.在較大的模型中，馬模型被認為是模型之一，但也被認為是挑戰性的模型之一。16.優點包括關節的大小和可及性，軟骨的厚度和生化成分，這些都接近人類24，以及軟骨下板是閉合的，這在許多較小的物種中并非如此。在模型的缺點中，也許手術后立即承重可能是最重要的25.關于馬模型的一個重要的倫理考慮因素是，馬是主要為了運動潛力而繁殖和飼養的動物。這使得馬與任何其他物種不同，除了狗之外，成為一個實驗物種，以及一個目標物種，顯然臨床上需要更好地治療（骨）軟骨關節疾病。26.

   在這項研究中，馬模型用于評估用無細胞CDM支架填充人造骨軟骨缺損的效果，使用（+P）或沒有（−P）陶瓷基底在軟骨下骨中壓接錨定。在為期8周的試點研究中，僅植入CDM植入物的結果與先前使用這些支架6，8的體內異位研究以及兔子的原位植入9，10的有希望的結果一致。在支架的位置，可以看到骨骼和軟骨階段的再生，盡管可以注意到關節表面的明顯壓痕。然而，試點研究的結果被認為足夠令人鼓舞，有理由進行更大規模的長期研究。

   雖然在主要研究中，臨床癥狀（如跛行或關節積液）受到限制，并且并非在所有馬匹中都可見，但在6個月時尸檢時的缺陷填充令人失望，并且在所有治療動物中明顯低于試點馬匹。宏觀和組織學分析證實存在大壓痕和下修復組織。從生物力學上講，這種組織的硬度平均比來自同一匹馬的健康軟骨的樣本低90%。相比之下，來自支架骨部分的3D打印CaP水泥很好地整合到周圍的骨組織中，類似于以前的原位研究13，27。雖然水泥的主要部分已被吸收并被新形成的骨頭取代，但在植入部位內仍然可以看到剩余的碎片。X射線衍射（XRD）分析清楚地證實，作為支架主要成分的刷子和莫氏石被*吸收，只能發現少量殘留的β-TCP，這可能是由于β-TCP的溶解度（∼0.4 mg / l）低于刷石（85 mg / l）和monetite（41 mg / l）28.所有衍射圖譜均顯示納米晶HA是主要成分，因為2Theta = 25.8°和31–35°左右的寬峰。這種透明質酸可能在支架植入后直接從α-TCP水解為缺鈣的透明質酸后形成29，或在較長的時間后通過在Ca存在下將刷石轉化為HA2+.后者通常出現在原位植入后的刷狀生物水泥中30，因為該化合物在生理pH值下熱力學不穩定。由于所用XRD的橫向分辨率為幾毫米2，HA也可能來自支架殘基旁邊新形成的骨礦物質。

    在長期研究中，有幾個因素可能導致植入物的性能有限。在去細胞化支架中，已知去細胞化過程的功效會影響宿主反應，并且在體外更積極的去細胞化與巨噬細胞表型優勢從M1到M2的轉移有關。31.雖然沒有得到很好的研究，但獸醫的臨床印象是，與其他物種相比，馬對免疫原性刺激相對敏感，這可能也影響了本研究中植入支架的命運。另一個潛在的非常重要的因素是最初的生物力學負荷，包括剪切和壓縮，植入的支架從馬匹從麻醉中恢復的那一刻起就一直受到。這是馬模型的一個的缺點。25，這是由于馬匹無法長時間卸載其四肢之一而沒有嚴重的并發癥。此外，CDM支架有限的整體機械性能可能通過阻礙力傳遞到下層骨骼而導致失效，最終導致這些區域的骨質流失。這強調了對機械穩定性更高的需求，例如，纖維增強結構32，33，用于處理這些機械上具有挑戰性的位置的缺陷。

通過包含再生細胞以進一步增強組織形成，結果也可能進一步改善。然而，當設想現成的解決方案（即無細胞結構）時，這將是一個復雜的因素。

    綜上所述，長期馬研究的不良結果與體外，異位體內和短期體內試點研究觀察到的有希望的結果不一致。在臨床上表現驚人的地方，只有相對輕微的跛行，在長期研究中，與為期8周的試點研究的結果相比，觀察到非常有限的缺陷填充。因此，這項研究強調了在評估治療關節缺陷的再生方法時，在具有挑戰性的模型中進行長期研究的必要性，即使體外工作甚至短期體內研究的結果可能是有希望的，因為治療效果可能會被高估。結果還表明，在長期研究期間，例如通過成像技術或滑液組成的高級分析，進行越來越多的深入監測可能具有實質性的附加值。

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